FRET peptidna tehnologija

Prijenos energije fluorescentne rezonancije (FRET)

Fluorescencijski rezonantni prijenos energije (FRET) je neradijacijski proces prijenosa energije u kojem se energija pobuđenog stanja donora prenosi u pobuđeno stanje akceptora kroz interakciju međumolekulskih električnih parova.Ovaj proces ne uključuje fotone i stoga nije radijacijski.Prednost ovog testa je što je brz, osjetljiv i jednostavan.

Boja koja se koristi u FRET testu može biti identična.Ali u većini primjena zapravo se koriste različite boje.Ukratko, prijenos energije svjetlosne rezonancije je prijenos para dipola od donora (boja 1) do akceptora (boja 2) kada je donorska skupina pobuđena.Općenito, emisijski spektar donorske fluoroforne skupine preklapa se s apsorpcijskim spektrom akceptorske skupine."Kada je udaljenost između dva fluorofora odgovarajuća (10 — 100 A), može se promatrati prijenos energije fluorofora od donora do akceptora."Način prijenosa energije ovisi o kemijskoj strukturi receptora:

1. Pretvara se u molekularnu vibraciju, odnosno nestaje blistavo svjetlo prijenosa energije.(Receptor je gasitelj svjetla)

2. Emisija je intenzivnija od samog receptora, što rezultira crvenim pomakom u sekundarnom fluorescentnom spektru.”(Receptori su emiteri svjetla).

Donorska skupina (EDANS) i akceptorski gen (DABCYL) ravnomjerno su povezani s prirodnim supstratom HIV proteaze, a kada supstrat nije odspojen, DABCYL može potisnuti EDANS i tada postati nemjerljiv za fluor.Nakon prekida veze s proteazom HIV-1, DABCYL više ne gasi EDANS, a EDANS luciferaze mogu se naknadno otkriti.Dostupnost inhibitora proteaze može se pratiti promjenama u intenzitetu fluorescencije EDANS-a.

FRET peptidi su prikladni alati za proučavanje nespecifičnosti peptidaze.Budući da se njegov reakcijski proces može kontinuirano pratiti, pruža prikladnu metodu za otkrivanje aktivnosti enzima.Sjaj koji nastaje nakon hidrolize peptidnih veza od strane donora/akceptora daje mjeru aktivnosti enzima pri nanomolarnim koncentracijama.Kada je FRET peptid netaknut, pokazuje iznenadni nestanak unutarnjeg bljeska, ali kada bilo koja peptidna veza nasuprot donora/akceptora pukne, on oslobađa bljesak, koji se može kontinuirano detektirati i aktivnost enzima se tada može kvantificirati.